微生物限度檢查中的一些常見(jiàn)問(wèn)題解答

1、問(wèn): 做無(wú)菌驗(yàn)時(shí)陽(yáng)性對(duì)照菌是怎么加入的?可以在加完培養(yǎng)基后用無(wú)菌的器把菌液注入嗎?
答:嚴(yán)格的說(shuō)是要在最后一遍沖洗液中加入陽(yáng)性對(duì)照菌的,這主要是考量濾膜對(duì)于陽(yáng)性菌的截留性～但是濾器如果可以提供濾膜對(duì)于陽(yáng)性菌的充分截留的話(huà)在最后的培養(yǎng)體系中加入陽(yáng)性菌也是未嘗不可的. 如果供試品沒(méi)有抑菌作用,可以在加完培養(yǎng)基后用無(wú)菌的器把菌液注入,搖勻如果供試品有抑菌作用,正如安哥洛卡所講,在最后一次沖洗液中加入陽(yáng)性對(duì)照菌,搖勻,抽慮,加培養(yǎng)基. 無(wú)菌檢查，加入陽(yáng)性的方法可以有許多種，可以根據(jù)個(gè)人的習(xí)慣。只是注意：1、避免人為污染。2、陽(yáng)性菌加入數(shù)量，關(guān)鍵詞:陽(yáng)性對(duì)照菌
2、問(wèn): 離心沉淀法的原理、操作和注意事項(xiàng)是什么?
答:原理:利用沉降系數(shù)的差異將供試品和微生物進(jìn)行分離;
操作:取規(guī)定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘(供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取全部上清液再離心)，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋劑至原規(guī)定量.
注意事項(xiàng):由于沉降系數(shù)比較小, 500r/min離心5min，黑曲霉、白色回收率為20%,因此其檢查不適宜用低速離心沉淀法.
關(guān)鍵詞:離心沉淀法
3、問(wèn): 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的微生物及無(wú)菌檢查,是否每次都要做?
答:是;
原因: 一 實(shí)驗(yàn)期內(nèi)可能會(huì)染菌;
二 后微生物并不是就徹底死亡,有些成為碎片,這些碎片在一定的條件和時(shí)間下,可以自我修復(fù)而復(fù)活.
三 穩(wěn)定性的考察，也應(yīng)包括有效期的考察，在此期間所有的項(xiàng)目都應(yīng)是合格的，無(wú)菌也是其中之一，如果在有效期內(nèi)無(wú)菌不合格，也可以說(shuō)明該藥品存在一定的缺陷，至少，有效期有問(wèn)題。
關(guān)鍵詞: 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
4、問(wèn):眼部給制劑如何做衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)?
答:液體制劑:無(wú)菌檢查;
半固體及固體制劑:微生物限度檢查
關(guān)鍵詞: 眼部給制劑
5、問(wèn):滴眼液的微生物限度為何進(jìn)行無(wú)菌檢查?
答: 一 滴眼劑產(chǎn)品系按照無(wú)菌工藝生產(chǎn)且終產(chǎn)品為產(chǎn)品,故其成品的微生物質(zhì)量應(yīng)要求統(tǒng)一為無(wú)菌;所以,滴眼劑產(chǎn)品的臨床合理用藥應(yīng)與其衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求一致,即將其微生物質(zhì)量要求統(tǒng)一為無(wú)菌,顯然較為合理;
二 滴眼劑的微生物質(zhì)量要求為無(wú)菌,是與各國(guó)典在滴眼劑要求上的統(tǒng)一,及對(duì)《中國(guó)藥典》此項(xiàng)規(guī)定合理性的及完善等方面看,滴眼劑成品的微生物質(zhì)量要求統(tǒng)一為無(wú)菌具有必要性。
三 同時(shí),中國(guó)已加入wto,進(jìn)出口藥品已有明確質(zhì)量要求(在國(guó)外藥典中,眼用藥品都以無(wú)菌要求),同時(shí)臨床用藥較加合理與規(guī)范。
故現(xiàn)行典將滴眼劑的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一為強(qiáng)制性無(wú)菌要求。
關(guān)鍵詞: 滴眼液 無(wú)菌檢查
6、問(wèn):如何進(jìn)行驗(yàn)證?
答: 可用生物指示劑進(jìn)行驗(yàn)證,
濕熱:濕熱脂肪芽孢桿菌孢子
干熱:枯草芽孢桿菌孢子
7、問(wèn):為凈度沉降菌的檢查只用營(yíng)養(yǎng)瓊脂?
答:一 玫瑰紅鈉培養(yǎng)基對(duì)的生長(zhǎng)有抑制作用,而營(yíng)養(yǎng)瓊脂對(duì)于的生長(zhǎng)則沒(méi)有抑制作用,所以選用營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基
二 營(yíng)養(yǎng)瓊脂主要為培養(yǎng),而且培養(yǎng)時(shí)間是2天,原因?yàn)闉樵松?生長(zhǎng)與繁殖的能力較霉菌等真核生物強(qiáng),所以控制了,霉菌等也在一定程度上也得到了控制
三 廠家在制定自己的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí),可以同時(shí)對(duì)和進(jìn)行控制.
關(guān)鍵詞:沉降菌
8、問(wèn): 微生物培養(yǎng)時(shí)間范圍如何界定?
答: 含量測(cè)定所允許的誤差為±2%,如果照此限度,無(wú)菌培養(yǎng)時(shí)間為14天*24小時(shí)/天=336小時(shí),它的2%為6.72小時(shí),前后共13.44小時(shí);又加上無(wú)菌檢驗(yàn)沒(méi)有必要達(dá)到含量測(cè)定所要求的精度,所以我們完全可以在培養(yǎng)的*十四天的任何上班時(shí)間觀察結(jié)果下結(jié)論.微生物限度檢查培養(yǎng)時(shí)間分別為48小時(shí)及72小時(shí), 它們的2%分別為0.96小時(shí),1.44小時(shí),即我們只能在準(zhǔn)確培養(yǎng)時(shí)間的前后1~2小時(shí)內(nèi)計(jì)數(shù).
關(guān)鍵詞: 微生物培養(yǎng)時(shí)間
9、問(wèn)：乳膏，需加聚山梨酯80、司盤(pán)、單硬脂酸甘油酯乳化，后離心集菌(離心后不分層)，再薄膜過(guò)濾。但基質(zhì)堵住膜孔，過(guò)濾速度非常慢，怎么辦?
答：1、可以用十六烷酸異丙酯萃取基質(zhì)，使之分層，取水層進(jìn)行薄膜過(guò)濾(回收率差)。
2、樣品加入吐溫-80，乳化(45度)-----薄膜過(guò)濾。
關(guān)鍵詞：乳膏、十六烷酸異丙酯、萃取、吐溫-80、乳化(45度)、薄膜過(guò)濾
10、問(wèn):陶瓦蓋作用及使用范圍
答:陶瓦蓋的主要作用為防止菌落蔓延生長(zhǎng)成片或發(fā)生重疊影響計(jì)數(shù),通常在在效價(jià)測(cè)定中使用,在微生物限度檢查中僅在易形成片狀菌某些劑型如蜜丸、水丸中使用.
關(guān)鍵詞:陶瓦蓋
11、問(wèn):如何根據(jù)物品的特性確定合格的時(shí)間和溫度?
答:一般情況下，含有糖分的培養(yǎng)基溫度需控制在115℃15～20min，不含糖分的培養(yǎng)基溫度控制在121℃15～20min，而含菌的培養(yǎng)基(使用過(guò))溫度需控制在121℃30min左右 ，此外每次使用時(shí)，應(yīng)放入必要的監(jiān)視指標(biāo)。
關(guān)鍵詞:時(shí)間 溫度
12、問(wèn):如何減少培養(yǎng)基靈敏度下降引起的誤差? 答:目前大多數(shù)單位使用干粉培養(yǎng)基，使用較方便，但由于其較易吸潮，如存放不當(dāng)出現(xiàn)凝塊，則其凝固性較差，應(yīng)避免使用。新鮮配制的培養(yǎng)基應(yīng)在2℃～20℃避光保存，但不得凍結(jié)，保存時(shí)間不得過(guò)2周。硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基儲(chǔ)存過(guò)程中，若氧化還原層**過(guò)1/5，須經(jīng)水浴加熱煮沸10min方可使用，但只限一次。否則可使培養(yǎng)基中糖、微生 物和氨基酸受到破壞，影響質(zhì)量
關(guān)鍵詞:培養(yǎng)基靈敏度
13、問(wèn):如何控制的培養(yǎng)時(shí)間?
答:不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)樣品總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響 樣品經(jīng)24h培養(yǎng)后，有的菌落很小，漏掉，培養(yǎng)48h后，菌落不但變大，而且還有很多新生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，培養(yǎng)72h后，菌落數(shù)增加不多，但菌落明顯變大，而且混雜的霉菌生長(zhǎng)旺盛，影響結(jié)果的觀察計(jì)數(shù)。同時(shí)這也是一些樣品經(jīng)72h培養(yǎng)后總數(shù)技術(shù)有明顯增加的一個(gè)原因。培養(yǎng)24h和培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)結(jié)果有明顯差異，后者合格率明顯降低，所以在規(guī)定的培養(yǎng)環(huán)境下，應(yīng)嚴(yán)格遵守培養(yǎng)時(shí)間，以便真實(shí)的反映出樣品中總數(shù)的水平。
關(guān)鍵詞: 培養(yǎng)時(shí)間
14、問(wèn):菌種保藏與管理應(yīng)執(zhí)行哪些程序?
答:菌種保藏與管理應(yīng)有完整的程序，保藏的菌種必須具備該菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)資料。一般是首先填寫(xiě)菌種卡片，登記菌種名稱(chēng)編號(hào)，來(lái)源歷史，形態(tài)特征，生化與學(xué)鑒定，以及菌種傳代次數(shù)、較宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、保藏方法、貯存條件及保藏地址等
關(guān)鍵詞:菌種保藏與管理
15、問(wèn):青霉素酶的保存條件及溫度對(duì)其活性的影響
答:青霉素酶能夠在4℃保存6 個(gè)月以上活性不發(fā)生顯著改變。與同時(shí)采用的加入甘油或增加氯化鈉濃度保護(hù)酶活性的方法比較, 沒(méi)有顯著的不同;
溫度對(duì)青霉素酶的活性影響很大。55 ℃時(shí)對(duì)青霉素g呈現(xiàn)較高水解活性, 隨著溫度的升高或降低, 酶水解活性逐漸下降。緩沖液ph 對(duì)酶活性存在一定的影響, 較適酸堿度為 ph 7.0 ,在應(yīng)用本酶進(jìn)行青霉素制劑無(wú)菌檢查等應(yīng)用時(shí), 需特別注意測(cè)試溫度及酸堿度的影響.
關(guān)鍵詞:青霉素酶 保存
16、問(wèn)：標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間
按f0=ft * 10(t-121)/10計(jì)算，f0要大于8，在160--170度是短時(shí)間就能做到的，為什么干熱要兩小時(shí)以上呢?
答：濕熱和干熱的效果是不同的， 飽和蒸汽的穿透性比干熱空氣穿透強(qiáng)得多,蒸汽冷凝時(shí)放出的潛熱傳給待品,使之升溫并使待品所帶的微生物尤其是表面的微生物發(fā)生水合作用, 從而加速了它們的死亡。所以在達(dá)到同樣效果的前提下,濕熱所需要的時(shí)間要短得多。
(公式 f0=ft * 10(t-121)/10 只適合于濕熱 ,f0系t=121℃及z=10℃下的ft值。如果把121℃理解為“標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)”,那么f0可理解為“標(biāo)準(zhǔn)值”)
關(guān)鍵詞：時(shí)間、濕熱、干熱
17、問(wèn)：驗(yàn)證是不是要3批樣品的一次，還是一批樣品的3次，還是3次樣品3次得實(shí)驗(yàn)?
答：1、驗(yàn)證的目的，是要考察實(shí)驗(yàn)方法的可行性(避免出現(xiàn)陽(yáng)性、陰性)，
2、在樣品的藥物組成、成份、給藥途徑一致的前提下，驗(yàn)證時(shí)，“同一個(gè)批號(hào)的做3次”或“3個(gè)批號(hào)的各做一次”，均可。
關(guān)鍵詞：驗(yàn)證、3次、1次
18、問(wèn)：做實(shí)驗(yàn)的好習(xí)慣是什么?
答：1.實(shí)驗(yàn)前后清潔洗手，完畢清理實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)，器皿洗凈歸原，儀器等電源關(guān)閉。 2.試劑、樣品標(biāo)簽詳細(xì)準(zhǔn)確，包括劑量，規(guī)格，時(shí)間，實(shí)驗(yàn)人員等等;實(shí)驗(yàn)記錄詳細(xì)準(zhǔn)確，以便備查和分析。 3.提前分析實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟，準(zhǔn)備好全部的試劑及相應(yīng)工具、儀器，不懂或者有疑問(wèn)的步驟和地方問(wèn)清楚，重點(diǎn)難點(diǎn)重點(diǎn)標(biāo)出，做到心中有數(shù);實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)分析。 4.科學(xué)計(jì)劃、合理分配時(shí)間，做到忙而不亂。實(shí)驗(yàn)中仔細(xì)觀察試驗(yàn)過(guò)程，及時(shí)記錄可疑或者需要注意的地方。 5.多讀文獻(xiàn)多與別人交流，開(kāi)拓思路，改進(jìn)方案，對(duì)于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展及方向做到一定的把握。
關(guān)鍵詞：做實(shí)驗(yàn)、好習(xí)慣
19、問(wèn)：限度檢查所用器皿用自來(lái)水洗后一定用純化水再洗嗎?
答：gmp認(rèn)證中關(guān)于qc的規(guī)程中分析用玻璃器皿清潔規(guī)程要求如下
1.0目的 提供玻璃器皿的清潔方法的文件指導(dǎo)。 2.0范圍 化驗(yàn)室部門(mén)所有玻璃器皿。 3.0責(zé)任 化驗(yàn)室人員。 4.0程序 4.1 玻璃器皿每次使用后，使用者必須使其清潔并放于固定位置備用。 4.2 一般玻璃器皿清潔，用飲用水或去污劑洗滌后，器壁應(yīng)不掛水珠，再用少量純化水沖洗器皿三次，放固定位置自然干燥。 4.3 定量分析用玻璃器皿(如滴定管;移液管等)清潔，先把器皿內(nèi)的水瀝掉，然后往其中加入洗液，浸泡一段時(shí)間，放掉洗液，用飲用水沖洗后，再用純化水沖洗三次，倒置自然干燥。 4.4 水分測(cè)定用的玻璃器皿清潔過(guò)程同1或2，清潔后置于105~107℃烘箱內(nèi)烘干。然后存放于干燥器中。
關(guān)鍵詞：限度檢查、器皿、純化水
20、問(wèn)：潔凈室甲醛氣體熏蒸驗(yàn)證方案是什么?
答：1、 甲醛方法
在所有的液中甲醛較常用。當(dāng)相對(duì)濕度在65%以上、溫度在24~40℃時(shí)，甲醛氣體的效果較好，但若采用過(guò)多的甲醛，會(huì)因聚合而析出白色粉未附在物或設(shè)備表面。一般甲醛的方法如下：
a：前先用絲綢浸用水(純化水)擦洗房間建筑物和設(shè)備表面，然后用5%香草酚溶液噴酒或擦洗，靜置1小時(shí)后，再用絲綢浸用水(純化水)擦洗一次。
b：計(jì)算體積(包括房間及風(fēng)管體積)，按10ml/m3的比例準(zhǔn)備濃度為36%的甲醛溶液(甲醛密度為1.1g/ml)，按2~3g/m3的比例準(zhǔn)備溶液。
c：在房間中放入試驗(yàn)裝置，如不銹鋼培養(yǎng)皿支架;直徑90mm雙碟玻璃培養(yǎng)皿;枯草桿菌試紙，每張?jiān)嚰埳峡莶輻U菌數(shù)量為1*106個(gè)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放2張?jiān)嚰垼?張做無(wú)菌試驗(yàn)，1張做含菌數(shù)試驗(yàn)。培養(yǎng)皿的數(shù)量應(yīng)根據(jù)房間面積確定。
d：流程：在不銹鋼容器中加入，用雙層紗布蓋住桶口，再倒入36%濃度的甲醛溶液 甲醛氣體擴(kuò)散(約30min) 啟動(dòng)空調(diào)器讓甲醛氣體循環(huán)(約20min) 關(guān)閉通風(fēng)系統(tǒng)，房間熏蒸，不少于7hr 房間排氣，用新鮮空氣置換(約2hr) 開(kāi)啟空調(diào)系統(tǒng) 用75%酒精噴酒環(huán)境。
e：質(zhì)監(jiān)部門(mén)取樣培養(yǎng)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：試紙內(nèi)枯草桿菌數(shù)量小于1*103個(gè)為合格。
f：取樣后用絲綢沾0.1%的新潔爾滅溶液擦洗機(jī)器表面;用0.1%新潔爾滅溶液或1%germ warfare溶液或75%酒精噴灑建筑物四周。0.1%新潔爾溶液與1%germ warfare溶液溶液每月輪換一次。
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